Man kan korrigera vissa mutationer
och introducera nya gensekvenser.

Man kan byta ut en gen mot en annan.

Tack för inbjudan. Det är väldigt
trevligt att vara tillbaka i Umeå.

Det känns som hemma.
Jag bodde här ett tag-

-och det var här jag utvecklade
CRISPR-Cas9-projektet.

Ibland undrar jag om jag skulle stå här
om jag inte hade kommit till Umeå.

Det var sommaren 2008-

-som jag fick idén att foga samman
två olika riktningar hos min forskning.

Om jag inte hade varit i Umeå vet jag
inte om jag hade kommit på den idén.

CRISPR-Cas9-tekniken
är ett RNA-styrt system-

-som existerar i bakterier.
CRISPR-Cas9 finns bara i bakterier.

Jag ska berätta lite mer allmänt
om CRISPR-Cas-biologi också.

CRISPR-Cas9 fungerar
som ett RNA-programmerbart enzym.

Här ser ni enzymet Cas9 som en sax
som programmeras av RNA-molekyler.

I naturen sker det med molekylerna
crRNA och tracrRNA.

Med hjälp av de här
RNA-komponenterna-

-kan Cas9 klippa upp DNA
på ett sekvens-specifikt sätt-

-och klippa upp dubbelsträngat DNA-

-genom att klippa upp DNA-strängarna
med olika nukleasdomänder.

Mekanismen fungerar
så länge det i genomet-

-uppströms från den sekvens
som RNA-molekylen riktar in sig på-

-finns en kort sekvens nukleotider som
kallas "Protospacer adjacent motifs".

När det gäller systemet från bakterien
Streptococcus pyogenes-

-som är det system som används
i hela världen för den här gentekniken-

-som kan användas i alla olika slags
celler och organismer-

-så är PAM-motivet på det genom
som man ska arbeta med NGG.

Det finns många NGG inom genomet.

Det förklarar varför systemet från
Streptococcus pyogenes fungerar bra.

Hela fältet med tillämpningar
av den här genredigeringstekniken-

-började för nästan fyra år sen.

Då publicerades en artikel i Science-

-av Elizabeth Pennisi, för
nästan fyra år sen, sommaren 2013:

"CRISPR-mani
- ett bakteriellt immunsystem"-

-"ger en potentiellt revolutionerande
teknik för genredigering."

"CRISPR-Cas9-tekniken möjliggör
precis genredigering i alla organismer."

Här ser ni en bakteriecell
som infekteras av virus, bakteriofager.

Det som är intressant är det faktum-

-att det kom fram tillämpningar
av tekniken väldigt fort.

Jag ska visa en annan bild senare.

Det är ett bra exempel
på en naturlig mekanism i bakterier-

-som man kan använda
på ett enkelt sätt-

-men som kan bli väldigt kraftfull.

Den teknik som nu används-

-skiljer sig inte så mycket från
de naturliga mekanismerna i bakterier.

Det är ett verktyg som har fått stort
genomslag inom biovetenskaperna.

Åtminstone när det gäller infektions-
sjukdomar så är det en viktig teknik-

-eftersom vi använder genetik-

-för att förstå de mekanismer
som ligger bakom olika sjukdomar-

-och för att identifiera
banor, gener och molekyler-

-som kan leda till
nya behandlingar och nya tekniker.

Det är det angreppssätt
som de flesta av oss...

De av oss som arbetar
med bakterieinfektioner-

-är intresserade
av grundläggande mekanismer-

-och vi hoppas att vi kan hitta nya sätt
att behandla bakterieinfektioner-

-särskilt med tanke på
hotet från antibiotikaresistens.

När man jobbar med bakterier
tänker man också alltid på-

-att bakterier innehåller många
intressanta enzym och mekanismer-

-som sedermera har kunnat användas
som molekylärbiologiska verktyg.

Med det i åtanke
vill jag kort visa några höjdpunkter-

-och viktiga upptäckter
inom grundläggande genetik-

-för att ge er
som inte är experter en känsla för-

-var CRISPR-Cas9
dyker upp i sammanhanget.

Under 1800-talet formulerades
genetikens grundläggande regler-.

-med Darwin och "Arternas uppkomst",
Mendels lagar om nedärvning-

-och Miescher,
som först isolerade DNA 1871.

Och i mitten av 1950-talet-

-kunde man visa att DNA
var bärare av genetisk information-

-man upptäckte DNA:s spiralstruktur
och man såg den genetiska koden.

Man ville verkligen förstå genernas
funktion och genomets hemlighet.

Man fick hjälp av bakterier och virus.

Jag vill nämna François Jacob
- jag kommer själv från Frankrike-

-och jag har forskat
på Pasteurinstitutet.

François Jacob
var en betydande makrobiolog...

...som arbetade med Jacques Monod
och André Lwoff på saker som...

Det var precis det som man kan hitta
i systemet CRISPR-Cas.

Det handlar om att förstå
proteiner med enzymfunktioner-

-att förstå hur gener
kan organiseras som operander-

-hypotesen att RNA kan ha
regulatoriska funktioner i genuttrycket-

-alla dogmer och principer
som man studerar hos bakterier-

-och interaktionen
mellan bakterier och lysogena fager.

Det är precis det
som CRISPR-Cas handlar om.

Han sa bland annat: "Naturen
är en trixare, inte en uppfinnare."

Jag gillar det citatet. Det handlar om
enzym och andra komponenter-

-som har identifierats
i bakterier och virus-

-och som kan trixa lite
med DNA och RNA-

-vilket har lett till att man
inom molekylärbiologin och genetiken-

-började titta på och utveckla enzym
som kan rekombinera DNA-

-som kan läsa DNA-koden-

-och sekvensera och förstärka DNA.

Sen utvecklades andra metoder
som utnyttjade RNA-interferens.

Mer nyligen utvecklades metoder
för två olika nukleaser-

-som utgjorde startskottet
för genredigeringstekniken-

-och gjorde det möjligt att göra precisa
justeringar av gener hos organismer-

-var zinkfingernukleaser
och TALEN-nukleaser-

-konstgjorda enzym som kan göra
precis det som CRISPR-Cas9 gör.

De kan klippa dubbelsträngat DNA
på specifika platser i genomet-

-men de fungerar
på ett mer komplicerat sätt-

-än CRISPR-Cas9,
som bygger på RNA-molekylen.

Här finns programmerbarheten
inbyggd i nukleaset.

Man måste alltså skapa nya nukleaser
för nya gensekvenser.

Det är en teknik som fungerar bra,
och som fortfarande används-

-men CRISPR-Cas9
gör det betydligt enklare-

-att förändra genomet
på ett specifikt sätt-

-och dessutom på ett billigare,
snabbare och mer mångsidigt sätt-

-tack vare hur mekanismen fungerar.

Jag vill bara berätta lite om
hur vi kom fram till det här systemet.

På mitt labb är vi intresserade
av att förstå de mekanismer-

-som styr sjukdomar som orsakas
av Streptococcus pyogenes-

-en bakterie som angriper människor.
Här ser vi bakterien färgad i rött-

-när den angriper epitelceller,
som är färgade gröna i bilden.

Vi arbetar med olika slags mekanismer
och försöker förstå-

-hur de här mekanismerna gör att
bakterien kan angripa mänskliga celler.

Vi är också delvis intresserade av
människans försvar mot bakterien.

Vi arbetar med olika
regleringsmekanismer som styr-

-moduleringen av de faktorer
som är viktiga för bakterien-

-och dess överlevnad
i en stressig miljö:

Virulensfaktorer och andra faktorer
som gör att bakterien anpassar sig.

Jag började med små RNA-molekyler
för ungefär femton år sen.

Vi jobbade med små RNA-molekyler-

-som deltog i reglerandet av virulens-
faktorer hos Streptococcus pyogenes.

Här ser in kortfattat de mekanismer...

...som används av sRNA,
små RNA-molekyler i bakterier.

När vi började med sRNA visste vi
att de interagerar med budbärar-RNA-

-och förändrar då stabiliseringen
hos budbärar-RNA:s mål.

De kan också aktivera eller inhibera
translation genom olika mekanismer.

De kan också aktivera eller hindra
olika proteiners funktioner.

Det vi inte hade då,
som CRISPR-Cas9 ger-

-är små budbärar-RNA-molekyler som
kan reglera andra små RNA-molekyler.

Dessutom kan små budbärar-RNA
interagera direkt med DNA-

-och förändra genomet.
Det är det CRISPR-Cas9 gör.

Det här är två stora mekanismer
där CRISPR-Cas9 kan spela roll-

-och där man med CRISPR-Cas9
kan angripa specifika delar av DNA.

2006, för lite mer än elva år sen,
när jag var chefsforskare i Wien-

-började vi leta efter
nya små RNA-molekyler i S. pyogenes.

Vi använde ett angreppssätt
hämtat från bioinformatiken-

-som gjorde att vi kunde hitta
nya små budbärar-RNA.

Här har jag valt ut dem
där vi kunde hitta ett fint uttryck.

Vi fokuserade på små budbärar-RNA-

-däribland den RNA-molekyl
som nu är känd som tracrRNA.

Det här är en skärmdump därifrån.

Vi kunde se att tracrRNA
uttrycktes i tre olika former-

-som oftast uttrycktes efter varandra.

Det handlar om kontroller för 5s rRNA.

Vi märkte ut början och slutet
för dessa uttryck för tracrRNA-

-med hjälp av
flera olika analysmetoder.

Vi såg att RNA
kodades i närheten av en gen-

-som kodade för ett protein-

-som kallades CRISPR-protein
från Streptococcus thermophilus.

Det innehöll två nukleasdomäner,
RuvC-nukleas och HNH-nukleas.

Det här handlar egentligen
om Cas9-proteinet-

-som alla vet
utgör en del av den här tekniken.

Man hade redan
visat stort intresse för den här genen.

Vi ville arbeta med CRISPR-systemet,
som jag visar på nästa bild.

När det gällde tracrRNA ville vi se på
potentiella mål för budbärar-RNA.

Vi hittade ett bra mål
som kodade för en virulensfaktor.

Vi tänkte då att interaktionen
mellan tracrRNA och mRNA-

-skulle förändra virulensfaktorn.

Vi testade olika
möjliga uttrycksskillnader-

-hos den här faktorn
på mRNA-nivå och proteinnivå-

-vi jämförde olika typer av S. pyogenes
med knock-out av tracrRNA-

-vi såg på olika fenotyper som ansvarar
för bildandet av den här faktorn-

-som är ett protein
som ingår i etytrocytlysis-

-men vi kunde inte förstå
den här interaktionen. Nu vet vi varför.

Man har visat att tracrRNA spelar roll
hos reglerandet av virulensfaktorer-

-hos en annan bakterie,
men vi började bli lite desperata.

Sen började vi också
titta på CRISPR-systemet-

-eftersom vi nu också
kunde identifiera crRNA.

Det gjorde att vi började studera
ett annan slags infektionsbiologi-

-där bakterien är värden, och den
angrips av rörliga genetiska element.

Jag ska senare visa hur olika former
av RNA påverkar den här interaktionen.

Rörliga genetiska element kan bestå av
plasmider, transposoner och fager.

De kan föra in
intressanta gener i en bakterie-

-till exempel gener som gör bakterien
resistent mot antibiotika-

-eller som gör att bakterien kan
anpassa sig bättre till sin omgivning.

När det gäller fager
som infekterar bakterieceller-

-så injiceras genomet
från fagerna in i bakteriecellerna-

-och där kan det
börja producera virala partiklar-

-som kan lysera bakteriecellen
och döda andra bakterieceller.

När det gäller till exempel
Streptococcus pyogenes-

-kan den invaderande fagens DNA
integreras i bakterien som en profag.

Det kan leda till nya gener,
som ibland kodar för virulensfaktorer.

När bakterier eller arkéer-

-angrips av de här genominkräktarna
så måste de försvara sig-

-och de har försvarssystem
mot alla olika sorters angrepp.

De kan använda olika försvarssystem-

-som inbyggda försvarssystem-

-som har lett till
upptäckten av restriktionsenzym.

De här restriktionssystemen ses som
bakteriernas inbyggda immunsystem-

-och de består av det här enzymet
som har använts för kloning.

CRISPR-Cas
är ett annat slags immunsystem.

Det är det enda
adaptiva immunsystemet-

-om man pratar om
adaptiva och inbyggda immunsystem.

Systemet är adaptivt på så sätt
att det först känner igen inkräktaren-

-och sen memorerar inkräktaren
så att försvarssystemet kan fungera.

Systemet består av ett antal gener
organiserade som operoner-

-som kodar för proteinkomponenterna
i CRISPR-Cas-systemet.

Nära det här operonet har man ett
antal upprepningar och utfyllnader-

-som kallas en CRISPR-rad-

-som består av först en startsekvens
som innehåller en promotorregion-

-och därefter ett antal väldigt korta
upprepade identiska sekvenser-

-och mellan dem finns upprepade
så kallade utfyllnadssekvenser-

-som kommer från sekvenser
från rörliga genetiska element.

Promotorn gör att CRISPR-raden
tas in i systemets RNA-komponenter-

-med hjälp av
Cas-proteiner och crRNA.

Immunsystemet har tre steg.
Först memorerandet av systemet-

-därefter uttrycket
genom crRNA och proteiner-

-och sen interferensen, där systemet
känner igen en återkommande fag.

Det fungerar så
att fagen vid en första infektion-

-injicerar sitt DNA i bakteriecellen.

Då kan de här Cas-proteinerna-

-känna igen fagens DNA
och klippa upp en bit av fagens DNA-

-och stoppa in den
i CRISPR-raden vid startsekvensen.

Det är ett sätt att memorera fagen-

-genom att föra in en markör
för fagen i bakteriecellens genom.

De här små utfyllnadssekvenserna
i olika färger-

-ska förstås som ett antal tidigare
infektioner som man har memorerat.

Sen fungerar systemet så-

-att de proteiner som känner igen
fagen vid en ny infektion uttrycks-

-och CRISPR-raden uttrycks
som en lång crRNA-molekyl-

-som kommer att utvecklas till
en enda mogen crRNA-

-som innehåller
en del av de upprepade sekvenserna-

-och en sekvens som har som mål
ett specifikt rörligt genetiskt element.

Sen sker en sammankoppling
av crRNA med ett proteinkomplex-

-och crRNA kan sen föra ut
det här proteinkomplexet-

-till den inkräktande fagen,
för att se om de känner igen den-

-det vill säga om det finns samma
sekvens hos crRNA och hos fagen.

Ett Cas-protein
känner igen den här interaktionen-

-och klipper då upp fagens genom.

Systemet
har en väldigt intressant historia-

-som jag inte har tid att berätta om.

Det började 1987
när en japansk grupp identifierade-

-ett antal upprepningar
i genomet hos E. coli.

Det följdes av några studier
som visade att CRISPR-raden-

-kunde transkriberas
genom olika stora RNA-molekyler.

Man tänkte att det hade att göra med
RNA-komponenter och RNA-mognad-

-och produktionen
av väldigt små RNA-molekyler.

Sen kunde bioinformatiker
visa att CRISPR-generna-

-kodade för proteiner som interagerade
med och kunde klippa i DNA och RNA.

Sen såg man att utfyllnadssekvenserna
matchade rörliga genetiska element-

-och hypotesen blev att det motsvarade
ett RNA-interferenssystem-

-som utgjorde ett adaptivt
immunsystem hos bakterier.

Detta kunde senare bevisas
för Streptococcus thermophilus.

Till en början trodde man, som
med RNA-interferens hos eukaryoter-

-att systemet angrep det mRNA-

-som kodas av fagens gener-

-tills man insåg att de proteiner
som ansvarar för interferensen-

-inte var de proteiner som klippte DNA.

CRISPR-Cas9-systemet har utvecklats
hos både bakterier och arkéer.

Systemet finns hos 50-60 procent
av bakterier och 90 procent av arkéer.

Man har beskrivit en klassificering.

Det här är en klassificering
från för två år sen-

-som grundas på sorten och antalet av
olika CRISPR-proteiner i operonet.

Man kan se att beroende på
vilken sorts CRISPR-Cas det är-

-så får CRISPR-associerade gener
olika organisation och olika särdrag.

CRISPR-Cas9
kallas för ett typ två-system.

När vi började arbeta med systemet
hade redan några kollegor-

-John van der Oost,
Marraffini och Sontheimer-

-för att nämna några, börjat se på
mekanismerna hos typ ett och tre.

De visade att det behövs
ett komplex av proteiner-

-som styrs av ett matchat crRNA
för att skapa interferens.

Typ två-systemet är annorlunda.

I stället för en serie gener är det bara
en gen som kodar för Cas9-proteinet.

Det finns också en skillnad hos
proteinet som producerar crRNA-

-som inte finns hos typ två, så när vi
började arbeta med typ två insåg vi-

-att vi hade att göra med en mekanism
som skilde sig från typ ett och tre-

-eftersom bara en gen
stod bakom interferensen.

Detta hade redan bevisats-

-även om man
inte förstod mekanismerna.

Jag vill gå tillbaka till tracrRNA-
molekylen som finns i typ två-systemet.

Vi ville också studera CRISPR
i Streptococcus pyogenes-

-eftersom vi såg att utfyllnads-
sekvenserna i typ två-systemet-

-kan angripa lysogena fager-

-som kan förflytta virulenta gener
mellan olika kliniska isolat.

Vi ville visa att CRISPR-Cas kunde
minska mängden virulenta gener-

-i kliniska isolat
av Streptococcus pyogenes-

-genom att begränsa de lysogena fager
som kodar för virulensfaktorerna.

Vi ville verkligen förstå mekanismen.

Vi insåg att tracrRNA
inte riktade in sig-

-på mRNA
som kodade för virulensfaktorer.

Vi började ana att tracrRNA
spelade en roll i typ två-systemet.

Till slut kom vi fram till
att det spelar en nyckelroll-

-och att det är utmärkande
för CRISPR-Cas9-systemet.

Det är den RNA-molekylen
som utgör skillnaden.

Vi använde
ett gentekniskt tillvägagångssätt-

-med de verktyg som jag hade
utvecklat för genredigering i bakterier.

Vi kunde visa
att tracrRNA är en RNA-molekyl-

-som kan skapa baspar med
crRNA-molekylernas upprepningar.

Här ser ni det duplex som skapas av
tracrRNA och långa RNA-molekyler.

Det stabiliseras av Cas9-proteinet
och klipps upp av ribonukleas III-

-ett enzym som kodas
av de flesta bakteriearter.

Det leder till skapandet
av en mellanform av crRNA-

-som genomgår ytterligare
mognadsprocesser till en form-

-som innehåller en mogen form
av crRNA som kan rikta in sig på-

-motsvarande sekvens i fagen.

Sen har vi tracrRNA-duplexet
och Cas9 som håller ihop det.

Det är en väldigt specifik mekanism-

-som gör att tracrRNA-
och crRNA-duplexet-

-kan leda Cas9 till det inkräktande
genomet, som ni kan se här.

Man har ett mål-DNA-

-och en crRNA-sekvens
som bildar baspar med mål-DNA-

-och en interaktion
mellan crRNA och tracrRNA.

Experimentet visar hur tracrRNA och
crRNA leder Cas9 till att klippa DNA.

Man kan se att man kan klippa
i plasmider med olika former-

-bara när man har Cas9, plasmiden,
crRNA och tracrRNA samt magnesium.

Här ser ni de uppklippta fragmenten.

Det här är bara ett
av de många experiment som vi gjorde.

När vi sekvenserade
de här fragmenten-

-såg vi att brottet skedde tre baspar
uppströms om en viss PAM-sekvens-

-som består av NGG
hos Streptococcus pyogenes.

Den här sekvensen
måste finnas i genomet-

-precis nedströms om den sekvens
som crRNA riktar in sig på.

Det finns två möjliga ställen
där det kan ske.

Jag vill bara nämna att det här
gjordes in vitro med tracrRNA-

-och det överensstämde med en
tidigare studie av Sylvain Moineau-

-som visade att CRISPR-Cas9-
systemet kan klippa mål-DNA in vivo.

Då hade man
ännu inte beskrivit tracrRNA.

De upptäckte också att det skedde
ett brott tre baspar bort från PAM-

-och Moineau kunde visa betydelsen
av den här PAM-sekvensen-

-som tidigare
hade identifierats av bioinformatiker.

Det fungerar så att Cas9 styrs av de
två RNA-sorterna till att hitta ett PAM.

Cas9 innehåller en domän som binder
till den här NGG-sekvensen.

Därefter söker den efter
den sekvens som motsvarar crRNA.

Det skapas ett så kallat R-loop-system
genom proteinets olika stadier-

-när det binder till RNA,
när det binder till PAM-

-och slutligen vid sökningen.

Därefter placeras Cas9:s
två nukleasdomäner på plats-

-så att de kan utföra
själva klippningen-

-där var och en av domänerna
klipper en sträng.

Man får alltså ett dubbelt DNA-brott
på den specifika plats som har valts ut.

Sen ville vi förenkla systemet-

-genom att använda
bara en enkel sgRNA-molekyl.

Beroende på
hur tekniken har utformats-

-och för vilka specifika ändamål-

-använder man ändå
dubbla RNA-molekyler ibland.

Vi ville kunna utnyttja
det här programmerbara systemet-

-som gör specifika dubbla DNA-brott
för gentekniska ändamål.

Det CRISPR-Cas9-systemet kan göra-

-är precis det som zinkfingernukleaser
eller TALEN-nukleaser gör.

De klipper upp dubbla DNA-strängar.

När man gör ett brott hos DNA
på en högre stående organism-

-kan man sätta i gång så kallade icke-
homologa reparationsmekanismer-

-som är mer eller mindre felbenägna
och kan skapa felaktigheter vid brottet.

Om man för in
en homolog DNA-sträng-

-så kan man ersätta
den sekvens där man gjorde brottet-

-med en annan sekvens.

Därigenom kan man skapa mutationer,
man kan reparera mutationer-

-man kan föra in
nya sekvenser i genomet-

-man kan ersätta gener
med andra gener-

-eller vissa delar av sekvenser
med andra sekvenser.

Man kan också göra
större förändringar.

När vi förstod
hur enkel mekanismen var-

-och att CRISPR-Cas
skulle kunna användas-

-för att rikta in sig
på genom och deras uttryck-

-var CRISPR-Cas9 det mest minimala
system som gick att använda.

Vår hypotes var att det här
RNA-programmerbara systemet-

-skulle kunna bli ett gentekniskt
verktyg i livets alla tre domäner-

-för biotekniska, biomedicinska
och genterapeutiska ändamål.

Sex månader efter att vi publicerade
en artikel i Science sommaren 2012-

-med min kollega Jennifer Doudna-

ett halvår senare såg vi
ett antal artiklar i början av 2013-

-som visade att tekniken fungerade
i människor, möss, bakterier, växter...

Det var många i Boston
som lade ner mycket arbete-

-på att visa att tekniken fungerade bra-

-i människoceller och i organoider
och i många olika modellorganismer.

Alla håller med om
att det är billigt och enkelt.

Det är effektivt om man använder
systemet från S. pyogenes.

Det är en väldigt användbar teknik
som gör att man kan utforma-

-olika typer av gRNA för att
rikta in sig på olika delar av genomet-

-och göra olika förändringar samtidigt.

Specificiteten
är väldigt bra för naturliga system-

-men många forskare arbetar med
att förbättra specificiteten-

-särskilt för att
kunna använda det inom medicin.

Systemet har låg toxicitet och man
forskar nu på olika överföringssystem.

Jag tycker om den här tekniken
för att den leder till förnyat intresse-

-för att förstå livets mekanismer
hos modellorganismer-

-där genetiken inte har varit enkel.

Nu när vi har ett effektivt system
pågår forskning om överföringssystem-

-för att kunna studera
världens mångfald.

Jag skulle dock vilja visa några
andra aspekter av CRISPR-Cas9.

Det är viktigt att förstå att systemets
natur gör det väldigt användbart.

Man kan slå ut en enkel nukleasdomän
och göra om ett nukleas-

-till ett RNA-programmerbart nikas,
som kan introducera bara ett brott-

-på en av de två DNA-strängarna.
Man kan också slå ut två domäner-

-och få ett RNA-programmerbart
DNA-bindande protein.

När man har RNA-programmerbara
nukleas kan man skapa mutationer.

Om man har den döda versionen
som inte kan klippa DNA-

-utan som bara kan binda till DNA
så kan man lägga till olika domäner-

-som kan göra om systemet till att
aktivera eller inhibera transkription.

Det har gjorts mycket forskning där
på den senaste tiden-

-där man ser på
aktivering och transkription.

Man kan också sammanföra Cas9
med en effektordomän-

-för att studera förändringar hos DNA
och epigenetiska fenomen-

-för att bara ta några exempel.

Här ser ni de duplex-RNA som är
viktiga för att systemet ska fungera.

Som jag sa använder alla systemet
från Streptococcus pyogenes-

-men nåt som vi
började titta på väldigt tidigt-

-och som har låtit oss
förstå mekanismen-

-var att vi tittade på mångfalden
av den här mekanismen hos bakterier.

Vi började tidigt
med bioinformatiska analyser-

-och vi upptäckte att systemet fanns
i över 350 olika bakteriearter.

Mina kollegor hittade systemet,
och även tracrRNA i många olika arter.

Vi upptäckte att det i CRISPR-Cas9-
systemet redan finns Cas9-enzym-

-tracrRNA och crRNA,
men det finns en stor variation-

-när det gäller sekvenser, så om
man jämför de olika Cas9-enzymen-

-alltså sekvenserna hos Cas9-enzymen
hos de 350 olika bakterierna-

-så ser man att man ibland bara har
en procent samma aminosyror.

Det finns också stor variation i
sekvenserna hos crRNA och tracrRNA.

Så trots att sekvenserna
hos tracrRNA utvecklas-

-och sekvenserna
hos crRNA utvecklas-

-så förblir kombinationen stabil,
vilket gjorde att vi förstod vikten-

-hos duplex-RNA:t och interaktionen
med Cas9-proteinerna.

Cas9-proteinerna
kan också ha olika storlek i naturen.

Det gjorde att vi kunde se
hur systemet hade utvecklats.

Det är viktigt att fortsätta utveckla
verktygslådan för CRISPR-Cas9.

Forskare vill ha små versioner av Cas9
som gör det enklare att använda-

-till exempel i människoceller.

Jag har pratat om PAM-sekvenser,
som måste finnas på målgenomet.

För S. pyogenes är det NGG,
men för olika bakteriearter-

-så har de olika versioner av PAM.

De kan ha fyra-fem nukleotider
eller kanske bara två.

Genom att förstå det här systemet
hos olika slags bakterier-

-kan vi utöka vår verktygslåda,
vilket kollegor till mig har gjort.

Alla håller dock med om att systemet
från S. pyogenes är det mest effektiva.

Det är det mest effektiva systemet-

-så vi hade tur
som jobbade med just S. pyogenes.

Anledningen är att Cas9-enzymet
hos S. pyogenes är särskilt flexibelt-

-och det har väldigt stark
helikas-aktivitet för att öppna upp DNA.

Jag ska fatta mig väldigt kort.

Det här är ett viktigt verktyg
för att förstå geners funktioner-

-men jag gillar också
att den här tekniken är så mångsidig.

Man har kombinerat den
med andra gentekniker-

-som har utvecklats
under de senaste 40 åren.

Vi har sett att vår gentekniska
verktygslåda har blivit större-

-genom att kombinera olika tekniker.

Det används inom
forskning och utveckling och medicin-

-där det är viktigt när vi arbetar med
infektionssjukdomar och patogener-

-att hitta korrekta, kliniskt relevanta
modeller för sjukdomar.

CRISPR-tekniken är till exempel
väldigt användbar i djurmodeller-

-där man kan se på funktionen hos
vissa interaktorer hos olika patogener.

Det är också viktigt vid validering
inom läkemedelsutveckling-

-och i alla de screeningmetoder,
där man nu använder CRISPR-Cas9.

Det är också viktigt
inom växtbiologi och syntetisk biologi.

Vi såg tidigare att typ två
var det mest minimala systemet-

-men man har börjat se på andra
system sen vi började med typ två.

Jag vill bara nämna typ fem A,
där mekanismen är ännu enklare.

Man behöver inte två RNA
och ett protein, utan bara ett protein-

-med en ribonukleas-domän
och en deoxiribonukleas-domän.

Det här Cas-proteinet
som numera kallas Cpf1-

-kan binda
till den långa crRNA-molekylen-

-och den kan generera mogna crRNA-

-som förblir bundna till Cpf1-

-det Cas-protein
som har fått dem att mogna.

Det mogna RNA, som är bundet till
proteinet, kan ledas till målgenomet-

-där proteinet,
som har en deoxiribonukleasdomän-

-klipper DNA vid specifika sekvenser.
Det är ett protein som gör allt.

Många kollegor
har arbetat med olika system-

-och memoreringsprocessen beskrevs
i en väldigt bra artikel nyligen.

Jag skulle vilja avsluta med att tacka
mina institutioner i Österrike-

-och förstås i Sverige.
Alla olika loggor fick inte plats.

Vi har fått viktigt stöd
från Wallenbergstiftelsen-

-Kempestiftelserna
och Göran Gustafssons stiftelse.

Jag arbetar nu i Tyskland med ett
väldigt bra team med unga forskare-

-som är väldigt motiverade och duktiga.

Jag har arbetat tillsammans med
Jörg Vogel, som Peter nämnde-

-Jennifer Doudna i Berkeley,
Martin Jinek i Zürich-

-och Eugene Koonin
i Bethesda i USA.

Det här var mitt team förra sommaren.

Jag måste också nämna de här två
företagen. Tack för uppmärksamheten.

Jag hoppas att det inte var för långt.

Översättning: Peeter S. Randsalu
www.btistudios.com